Allogeniczne mezenchymalne komórki zrębu z pępowiny poprawiają funkcję ruchową przy prenatalnej operacji przepukliny oponowo-rdzeniowej: badanie w modelu owczym

Najważniejsze punkty i wnioski:

To badanie przedkliniczne przeprowadzono na płodach owiec. Nie leczono żadnych dzieci. Francuski zespół z Paryża, który przygotowuje się do dodania mezenchymalnych komórek zrębu z pępowiny (UC-MSC) do prenatalnej operacji przepukliny oponowo-rdzeniowej, podczas operacji umieszczał na odsłoniętym rdzeniu kręgowym płodów jagniąt łatkę fibrynową z UC-MSC od owiec-dawców. Jagnięta operowane z łatką z komórkami porównano z jagniętami operowanymi z taką samą łatką bez komórek.

Dzień po urodzeniu jagnięta, które otrzymały komórki, poruszały się lepiej, żadne z nich nie miało wycieku moczu, a pod mikroskopem ich rdzenie kręgowe miały więcej dużych komórek nerwowych i znacznie mniej tkanki bliznowatej. Różnice te były istotne statystycznie. Inne pomiary, w tym badania przewodnictwa nerwowego, wielkość mięśni i grubość zwieraczy, nie wykazały różnic. Żywo urodziło się tylko dziewięć jagniąt, które obserwowano przez 24 godziny, więc badanie nic nie mówi o skutkach długoterminowych ani o bezpieczeństwie.

Cel:

Zbadanie wpływu łatki z allogenicznymi (od dawcy) UC-MSC zastosowanej podczas operacji płodowej na funkcję ruchową i funkcję zwieraczy w 24. godzinie życia w owczym modelu przepukliny oponowo-rdzeniowej.

Metody:

Badanie zatwierdził francuski Krajowy Komitet ds. Badań na Zwierzętach i prowadzono je zgodnie z wytycznymi ARRIVE dotyczącymi badań na zwierzętach.

UC-MSC hodowano metodą eksplantów z pępowin trzech jagniąt urodzonych przez cięcie cesarskie w pobliżu terminu porodu. Komórki miały kształt wrzecionowaty, przylegały do plastiku i miały owcze markery MSC CD29, CD90, CD73, CD44 i CD166, ale nie CD31 ani CD45. Do każdej łatki z komórkami wmieszano 17 milionów komórek z pasażu 5 do fibrynogenu z komercyjnego zestawu kleju fibrynowego (Evicel) i utrwalono trombiną. Łatki kontrolne wykonano w ten sam sposób bez komórek. Oba rodzaje były elastyczne i miały grubość około 2 mm.

U płodów jagniąt w 75. dniu ciąży chirurgicznie wytworzono wadę kręgosłupa (laminektomia L1 do L5 z usunięciem opony twardej) i naprawiono ją w 89. dniu. Łatkę układano na rdzeniu kręgowym, a skórę płodu zamykano nad nią. Chirurdzy wiedzieli, której łatki użyto. Jagnięta urodziły się przez cięcie cesarskie w 140. do 142. dniu i były utrzymywane przy życiu przez 24 godziny.

W 2. i 24. godzinie życia lekarz rehabilitacji dziecięcej i lekarz weterynarii chirurg, obaj nieznający przydziału do grup, oceniali ruch za pomocą skali Sheep Locomotor Rating (SLR, od 0 przy całkowitym porażeniu do 15 przy prawidłowym ruchu), a także stanie, odruchy, czucie i zanik mięśni (amiotrofię). Jagnię uznawano za trzymające mocz, jeśli przyjmowało prawidłową postawę do oddawania moczu i nie miało wycieku przy ucisku pęcherza. W 24. godzinie, w znieczuleniu, neurolog weterynaryjny nieznający przydziału rejestrował aktywność elektryczną mięśni, przewodnictwo nerwowe i rdzeniowe potencjały wywołane, a tomografia kręgosłupa mierzyła wielkość wady. Następnie jagnięta poddano eutanazji. Neuropatolog nieznający przydziału mierzył pole przekroju rdzenia kręgowego, pole istoty szarej, gęstość dużych neuronów i grubość tkanki bliznowatej (włóknienia), a wszystkie główne narządy zbadano pod kątem guzów.

Badanie zaplanowano z czterema jagniętami w grupie, przy założeniu, że 90% leczonych i 10% kontrolnych jagniąt uzyska w SLR wynik powyżej 12. Grupy porównano testem U Manna-Whitneya i testem chi-kwadrat.

Wyniki:

Łatki umieszczono u 13 płodów. Cztery utracono: dwa poronienia (po jednym w każdej grupie) i dwa zgony płodów, jeden stwierdzony w czasie operacji naprawczej i jeden u leczonego płodu przy cięciu cesarskim. Łączna utrata płodów wyniosła 31%. Żywo urodziło się dziewięć jagniąt, 5 z łatką z komórkami i 4 z łatką kontrolną.

Bezpieczeństwo: Wszystkie dziewięć operacji naprawczych całkowicie się zagoiło. Żadne jagnię nie miało przepukliny tyłomózgowia i w żadnym narządzie nie znaleziono guza. Przyczyn czterech utrat płodów nie udało się ustalić, ponieważ autopsja nie była możliwa.

Ruch:

• SLR w 2. godzinie: mediana 2 (zakres od 1 do 7) z komórkami wobec 2 (od 1 do 6) bez nich, p = 0,83.
• SLR w 24. godzinie: mediana 14 (zakres od 13 do 15) z komórkami wobec 5 (od 4 do 14) bez nich, p = 0,04.
• Zdolność do samodzielnego stania: 5 z 5 z komórkami, 2 z 4 bez nich, p = 0,07 (nieistotne).
• Zanik mięśni kończyn tylnych: 0 z 5 z komórkami, 3 z 4 bez nich, p = 0,02.

Trzymanie moczu: Żadne z 5 leczonych jagniąt nie miało nietrzymania moczu, a wszystkie 4 kontrolne jagnięta je miały (p = 0,002). Autorzy zaznaczają, że była to prosta ocena kliniczna, niepotwierdzona badaniem pęcherza ani histologią.

Badania nerwów i tomografia kręgosłupa: Spontaniczna aktywność elektryczna mięśni, amplitudy i prędkości przewodnictwa nerwowego oraz rdzeniowe potencjały wywołane nie różniły się istotnie między grupami. Tomografia kręgosłupa wykazała w obu grupach wady o podobnej wielkości i podobne zagięcie kręgosłupa.

Rdzeń kręgowy pod mikroskopem:

• Gęstość dużych neuronów: 14,5 na mm² istoty szarej z komórkami wobec 5,6 bez nich (p = 0,001).
• Tkanka bliznowata między rdzeniem kręgowym a skórą: grubość 453 wobec 3921 mikrometrów (p = 0,03).
• Tkanka bliznowata wokół rdzenia kręgowego: grubość 47 wobec 158 mikrometrów (p = 0,0001).
• Pole istoty szarej (8,2 wobec 7,1 mm², p = 0,74) i pole przekroju rdzenia kręgowego (21,8 wobec 16,7 mm², p = 0,44) nie różniły się istotnie.

Mięśnie i zwieracze: Masa i wielkość włókien dwóch mięśni kończyn tylnych oraz grubość zwieraczy cewki moczowej i odbytu były podobne w obu grupach.

W pracy występują niespójności w raportowaniu. Tekst nazywa kilka wyników wartościami „średnimi”, podczas gdy tabele i metody podają mediany. Kilka zakresów w tabeli wyników pozardzeniowych nie może być poprawnych (na przykład mediana w grupie kontrolnej 13,7 przy zakresie od 45,3 do 49,4), a tabela tomografii kręgosłupa powtarza liczby z wierszy dotyczących masy mięśni. Nie wpływa to na główne wyniki przedstawione powyżej.

Wnioski:

Autorzy stwierdzają, że łatki z UC-MSC stosowane przy prenatalnej naprawie przepukliny oponowo-rdzeniowej u owiec „poprawiają funkcję ruchową i funkcję zwieraczy”, wraz z lepszym zachowaniem rdzenia kręgowego i mniejszym włóknieniem, oraz że potrzebne są dalsze badania nad bezpieczeństwem długoterminowym i nad możliwością przeniesienia tej metody na ludzi.

Ograniczenia podane przez autorów:

• Mała liczebność próby, częściowo z powodu utraty płodów, częstej w tym modelu zwierzęcym.
• Obserwacja trwająca tylko 24 godziny, ponieważ opieka nad potencjalnie niepełnosprawnymi jagniętami jest kosztowna i złożona, co ogranicza wnioski dotyczące skuteczności, tolerancji i bezpieczeństwa.
• Subiektywna ocena trzymania moczu, niepotwierdzona histologicznie.
• Badania przewodnictwa nerwowego i potencjałów wywołanych nie wykazały różnic, być może dlatego, że badanie było zbyt małe, lub dlatego, że obwody nerwowe owiec i ludzi się różnią.

Inne kwestie również skłaniają do ostrożności. Chirurdzy nie byli zaślepieni. Zdolność do stania nie różniła się istotnie. Wynik dotyczący ruchu w 24. godzinie opiera się na porównaniu 5 i 4 zwierząt, a jedno kontrolne jagnię uzyskało 14 punktów, tyle samo co mediana w grupie leczonej.

Czym to badanie różni się od badania zespołu z komórkami ludzkimi: Ta sama grupa powtórzyła później eksperyment z UC-MSC z ludzkich pępowin (streszczenie badania). W tym wcześniejszym badaniu komórki pochodziły od owiec, ruch i trzymanie moczu różniły się istotnie w 24. godzinie, a tkanka bliznowata była istotnie zmniejszona, natomiast pole przekroju rdzenia kręgowego i pole istoty szarej się nie różniły. W badaniu z komórkami ludzkimi wzorzec był niemal odwrotny. Pole przekroju rdzenia kręgowego, pole istoty szarej i gęstość neuronów były istotnie lepsze, ale wyniki dotyczące ruchu i zmniejszenia tkanki bliznowatej nie osiągnęły istotności. Autorzy późniejszego badania sugerowali, że trzy ludzkie pępowiny od dawców mogły słabiej wytwarzać czynniki ochronne. Oba badania były małe, a jagnięta obserwowano tylko przez 24 godziny.

Informacje dodatkowe:

Autorzy zaznaczają, że nawet po operacji płodowej 71% dzieci z przepukliną oponowo-rdzeniową nie chodzi samodzielnie w wieku ośmiu lat, a 75% wymaga codziennego cewnikowania pęcherza do dziesiątego roku życia. Wcześniejszy eksperyment zespołu na owcach wykazał jedynie niewielki, nieistotny wpływ UC-MSC na ruch w 2. godzinie życia, co według autorów było zbyt wcześnie po urodzeniu, aby to ocenić.

Kalifornijska grupa, stosująca w tym samym modelu MSC z łożyska z wczesnej ciąży na macierzy świńskiej, opisała medianę SLR 15 z komórkami wobec 6 bez nich oraz więcej zachowanych neuronów. Grupa ta nie stwierdziła różnic w funkcji pęcherza, więc wynik dotyczący trzymania moczu jest tu nowy i niepotwierdzony.

Autorzy uważają, że UC-MSC działają głównie poprzez uwalnianie czynników wzrostu i czynników ochronnych, a nie poprzez przekształcanie się w komórki nerwowe, ale zaznaczają, że dokładne mechanizmy nie są jeszcze znane. Sugerują, że zmniejszenie tkanki bliznowatej może mieć znaczenie dla zespołu uwięzionego rdzenia, częstego problemu po operacji przepukliny oponowo-rdzeniowej. We wcześniejszym badaniu tej grupy, śledzącym losy komórek, przeszczepionych komórek nie znaleziono w odległych narządach.

Badanie sfinansowały dwie francuskie fundacje wspierające badania medyczne, Fondation de l’Avenir i Fondation pour la Recherche Médicale. Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Czasopismo opublikowało towarzyszący komentarz autorstwa Anny L. David.