Bezpieczeństwo i skuteczność ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu z pępowiny w płodowej naprawie przepukliny oponowo-rdzeniowej u owiec

Najważniejsze punkty i wnioski:

To badanie przedkliniczne przeprowadzono na płodach owiec. Nie leczono żadnych dzieci. Francuski zespół z Paryża przygotowuje program chirurgii płodowej, w którym do prenatalnej naprawy przepukliny oponowo-rdzeniowej dodaje się mezenchymalne komórki zrębu z pępowiny (UC-MSC). Praca opisuje pierwszy test ludzkich UC-MSC, typu komórek szeroko stosowanego w klinicznej terapii komórkowej, nałożonych na rdzeń kręgowy płodów jagniąt.

Jagnięta, które otrzymały komórki, miały w badaniu histologicznym lepiej zachowany rdzeń kręgowy, a różnica była istotna statystycznie. Miały też tendencję do lepszego poruszania się, choć wyniki dotyczące ruchu nie osiągnęły istotności statystycznej. Żywo urodziło się tylko dziewięć jagniąt, które badano przez 24 godziny. Utracono prawie połowę wszystkich operowanych płodów. Autorzy stwierdzają, że przeniesienie metody na ludzi musi poczekać na dłuższe dane z badań na zwierzętach.

Cel:

Ocena bezpieczeństwa i skuteczności łatki fibrynowej z ludzkimi UC-MSC stosowanej jako uzupełnienie płodowej chirurgicznej naprawy przepukliny oponowo-rdzeniowej w modelu owczym.

Metody:

UC-MSC izolowano metodą eksplantów z trzech ludzkich pępowin, oddanych za zgodą przez kobiety po porodzie drogami natury. Komórki spełniały definicję International Society for Cellular Therapy. Przylegały do plastiku i miały kształt wrzecionowaty, były dodatnie pod względem CD73, CD90 i CD105 oraz ujemne pod względem CD45, CD11b, CD14, CD34 i CD79a.

Łatkę wykonywano dzień przed operacją z komercyjnego zestawu kleju fibrynowego (Evicel). Do łatki z komórkami wmieszano 17 milionów UC-MSC z pasażu 5 do roztworu fibrynogenu, zanim utrwalono go trombiną na szalce. Łatki kontrolne były identyczne, ale nie zawierały komórek. W mikroskopii poklatkowej komórki swobodnie przemieszczały się w łatce i w ciągu 72 godzin przyjmowały swój prawidłowy wrzecionowaty kształt.

U płodów jagniąt w 75. dniu ciąży chirurgicznie wytworzono wadę kręgosłupa (laminektomia L1 do L5 z usunięciem opony twardej). Naprawiano ją 14 dni później, w 89. dniu, układając łatkę na rdzeniu kręgowym i zamykając nad nią skórę płodu. Owce codziennie badano pod kątem stanu ogólnego, temperatury i gojenia rany. Jagnięta urodziły się przez cięcie cesarskie w 142. dniu.

Lekarz weterynarii nieznający rodzaju łatki oceniał ruch w 2. i 24. godzinie życia za pomocą skali Sheep Locomotor Rating (0 oznacza całkowite porażenie kończyn tylnych, 15 ruch prawidłowy). Następnie jagnięta poddawano eutanazji. Wszystkie główne narządy badano gołym okiem i pod mikroskopem pod kątem guzów. Na poziomie naprawy L3-L4 zespół mierzył pole przekroju rdzenia kręgowego, pole istoty szarej, liczbę dużych neuronów (neuronów ruchowych) na milimetr kwadratowy istoty szarej oraz grubość tkanki bliznowatej. Grupy porównano testem U Manna-Whitneya.

Wyniki:

Wadę wytworzono u 17 płodów. Dwa urodziły się martwe przed naprawą, więc naprawę przeprowadzono u 15, z czego 8 z łatką z komórkami i 7 z łatką kontrolną. Po naprawie utracono 2 z 8 w grupie z komórkami i 4 z 7 w grupie kontrolnej. Łączna utrata płodów wyniosła 47% (8 z 17). Ogółem żywo urodziło się 9 jagniąt, 6 z komórkami i 3 kontrolne.

Bezpieczeństwo: U żadnej owcy nie wystąpiła gorączka ani inne powikłanie i nie było oznak odrzucenia ludzkich komórek. Naprawa całkowicie się zagoiła u wszystkich dziewięciu jagniąt, bez wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego i bez zakażenia. U żadnego jagnięcia nie znaleziono guza w badaniu klinicznym ani w żadnym narządzie 54 dni po nałożeniu komórek. Żadne jagnię nie miało przepukliny tyłomózgowia.

Ruch:

• Wynik oceny ruchu w 2. godzinie: mediana 4,0 (zakres od 0 do 13) z komórkami wobec 2,0 (od 0 do 5) bez nich, p = 0,32.
• Wynik oceny ruchu w 24. godzinie: mediana 15,0 (zakres od 2 do 15) z komórkami wobec 2,0 (od 2 do 5) bez nich, p = 0,07.
• Zdolność do samodzielnego stania: 3 z 5 z komórkami, 0 z 3 bez nich, p = 0,08.
• Zanik mięśni: 1 z 6 z komórkami, 2 z 3 bez nich, p = 0,13.

Żadna z tych różnic nie osiąga przyjętego progu p poniżej 0,05. Co najmniej jedno leczone jagnię uzyskało tylko 2 punkty, czyli nie więcej niż jagnięta kontrolne.

Rdzeń kręgowy pod mikroskopem:

• Gęstość dużych neuronów: 9,9 na mm² istoty szarej z komórkami wobec 6,3 bez nich (p = 0,04).
• Pole istoty szarej: 6,2 wobec 1,9 mm² (p = 0,01).
• Pole przekroju rdzenia kręgowego: 16,1 wobec 7,5 mm² (p = 0,02).
• Grubość blizny wokół rdzenia: 70,9 wobec 253,7 mikrometra (p = 0,10). Grubość blizny w miejscu naprawy: 691,3 wobec 1684,4 mikrometra (p = 0,18). Obie były mniejsze z komórkami, bez osiągnięcia istotności.

Streszczenie opisuje wyniki oceny ruchu jako średnie. Tabela wyników w treści pracy oznacza je jako mediany z zakresami, co pasuje też do zastosowanego testu statystycznego. To streszczenie opiera się na tabeli.

Wnioski:

Autorzy stwierdzają, że ludzkie UC-MSC stosowane wraz z płodową operacją przepukliny oponowo-rdzeniowej były u owiec bezpieczne, że komórki najwyraźniej działają poprzez wydzielane substancje, a nie poprzez przekształcanie się w tkankę nerwową lub rozprzestrzenianie się po organizmie, oraz że zastosowanie u ludzi „zostanie rozważone po potwierdzeniu tych wyników dotyczących bezpieczeństwa w dłuższym okresie w modelu zwierzęcym”.

Ograniczenia podane przez autorów:

• Mała liczebność każdej grupy, z prawdopodobnie niewystarczającą mocą statystyczną.
• Wysoki odsetek utraty płodów, choć podobny jak w innych operacjach płodowych na dużych zwierzętach. W przeglądzie 232 jagniąt wiodącej grupy amerykańskiej przeżycie wyniosło tylko 43%.
• Z powodów finansowych jagniąt nie można było utrzymać przy życiu dłużej niż 24 godziny, więc nic nie wiadomo o średnio- i długoterminowym bezpieczeństwie ani funkcji. Trwa kolejne badanie z obserwacją do 1. i 6. miesiąca życia.
• Korzyść była mniejsza niż we wcześniejszych eksperymentach zespołu z owczymi UC-MSC. Autorzy podejrzewają zmienność między dawcami, ponieważ trzy użyte pępowiny mogły słabo wytwarzać czynniki ochronne. Testują dwa rozwiązania: łączenie komórek od kilku dawców oraz test siły działania do wyboru dawców o wysokim wydzielaniu.

Informacje dodatkowe:

Autorzy zaznaczają, że nawet po operacji płodowej 71% dzieci nie chodzi samodzielnie w wieku ośmiu lat, a 75% wymaga codziennego cewnikowania pęcherza w wieku dziesięciu lat. Kilka grup dodaje więc do operacji komórki. Grupa kalifornijska, stosująca komórki z łożyska, rozpoczęła badanie u ludzi. Francuska grupa podaje, że jako jedyna stosuje komórki z pępowiny.

W pracach laboratoryjnych zespołu ludzkie UC-MSC wydzielają czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego i czynnik wzrostu hepatocytów, które chronią komórki nerwowe, oraz czynniki przeciwbliznowe. We wcześniejszym badaniu śledzącym z użyciem komórek fluorescencyjnych przeszczepione komórki nie przemieszczały się do odległych narządów.

W kwestii bezpieczeństwa u ludzi autorzy powołują się na dwie duże metaanalizy badań z randomizacją dotyczących UC-MSC w innych schorzeniach, podawanych głównie dożylnie dorosłym i dzieciom, w których przemijająca gorączka była jedynym zdarzeniem niepożądanym związanym z komórkami i nie opisano guzów. Żadne z tych danych nie pochodzą z zastosowania u płodu, czego, jak przyznają autorzy, w przypadku UC-MSC nigdy nie badano.