Terapia in vivo w prenatalnej naprawie przepukliny oponowo-rdzeniowej w owczym modelu płodowym z użyciem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z pępowiny: dowód słuszności koncepcji

Najważniejsze punkty i wnioski:

To badanie na zwierzętach, przeprowadzone na nienarodzonych jagniętach. Nie leczono żadnych ludzi. Zespół z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf w Niemczech wytworzył w kręgosłupach płodów jagniąt wadę typu rozszczepu kręgosłupa (przepukliny oponowo-rdzeniowej), a następnie naprawił ją w łonie matki, tak jak robią to chirurdzy w ludzkiej chirurgii płodowej. U części jagniąt najpierw naniesiono bezpośrednio na odsłonięty rdzeń kręgowy ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) z pępowiny. Komórki pochodziły z Desacell, gotowego do użycia produktu wytworzonego z tkanki pępowiny jednego zdrowego noworodka. We wcześniejszych badaniach na owcach stosowano komórki osadzone na łatce, więc był to pierwszy opis nanoszenia w ten sposób płynnej zawiesiny komórek.

Badanie wykazało, że komórki udało się nanieść u wszystkich pięciu jagniąt, które miały je otrzymać. Nie mogło wykazać, czy komórki pomogły. Żywo urodziły się tylko trzy z siedmiu operowanych jagniąt (dwa leczone, jedno nieleczone), wszystkie trzy miały prawidłowe lub prawie prawidłowe wyniki oceny ruchu, a nieleczone jagnię miało w rzeczywistości największą gęstość przeżywających dużych komórek nerwowych. Autorzy sami stwierdzają, że próba była zbyt mała do jakiegokolwiek porównania między grupami.

Cel:

Głównym celem było sprawdzenie, czy gotowy do użycia produkt z ludzkich MSC z pępowiny (Desacell) można nanieść miejscowo na rdzeń kręgowy podczas płodowej naprawy rozszczepu kręgosłupa u owiec. Celami dodatkowymi było sprawdzenie, czy komórki poprawiają ruch w skali Sheep Locomotor Rating (SLR), czy zwiększają wielkość rdzenia kręgowego i jego istoty szarej oraz czy gęstość dużych komórek nerwowych ma związek z ruchem.

Metody:

Wykorzystano ciężarne owce od jednego hodowcy, wszystkie noszące jagnięta po tym samym tryku. Badanie zatwierdził urząd kraju związkowego Hamburg na podstawie niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt.

Około 75. dnia ciąży (ciąża owcy trwa około 145 dni) chirurdzy otwierali macicę, usuwali skórę, mięśnie grzbietu i łuki kostne kręgosłupa od L1 do L5 oraz otwierali błonę pokrywającą rdzeń kręgowy. Pozostawia to rdzeń odsłonięty na działanie płynu owodniowego, naśladując rozszczep kręgosłupa. Około 25 dni później jagnięta przechodziły drugą operację naprawczą. Jagnięta przydzielano w stosunku dwa do jednego do naprawy z komórkami lub bez nich. W grupie z komórkami usuwano tkankę bliznowatą znad rdzenia kręgowego i nanoszono bezpośrednio na rdzeń 1 mL zawiesiny żelowej Desacell zawierającej 30 milionów komórek. Następnie u wszystkich jagniąt zakładano wielowarstwową łatkę i zamykano skórę. W ciążach bliźniaczych jeden bliźniak był leczony, a drugi stanowił kontrolę lub nie był operowany.

Komórki pochodziły z jednej pępowiny od dawcy, spełniały międzynarodowe kryteria tożsamości MSC i zostały zbadane pod kątem jałowości, mykoplazm i endotoksyn. Rozmrażano je, płukano, liczono i wysyłano w chłodzie (4 °C) do miejsca operacji.

Jagnięta rodziły się w terminie i były filmowane w 2. i 48. godzinie po urodzeniu. Oceniający, którzy nie wiedzieli, które jagnięta otrzymały komórki, punktowali ruch w 15-punktowej skali SLR, w której 15 oznacza prawidłowe chodzenie, a 0 do 4 ciężkie upośledzenie. Następnie jagnięta poddawano eutanazji, a lędźwiowy odcinek rdzenia kręgowego dzielono na pięć do ośmiu segmentów, barwiono i mierzono. Neuropatolog, również zaślepiony, liczył duże komórki nerwowe ruchowe na milimetr kwadratowy istoty szarej. Przed badaniem autorzy obliczyli, że grupy liczące trzy i sześć jagniąt dadzą moc zaledwie 25,5%, co oznacza, że rzeczywista różnica najprawdopodobniej zostałaby przeoczona.

Wyniki:

Przeżycie: Wady wytworzono u 11 płodów jagniąt, średnio w 76,9. dniu.

• Trzy utracono po pierwszej operacji. U jednej owcy doszło do rozejścia się rany z niedrożnością jelit i owcę poddano eutanazji, jeden płód zmarł po gorączce u owcy, a jeden zmarł w dniu powikłania rany.
• U kolejnego jagnięcia nie udało się chirurgicznie dotrzeć do płodu, więc operację naprawczą przeprowadzono u siedmiu jagniąt, średnio w 104,3. dniu. Pięć otrzymało komórki, a dwa nie.
• Cztery kolejne płody zmarły 11 do 17 dni po naprawie: trzy z pięciu leczonych jagniąt i jedno z dwóch nieleczonych. Jeden płód miał ropień grzybiczy przy kręgosłupie z uogólnionym zakażeniem grzybiczym. Przyczyna pozostałych zgonów była niejasna.
• Trzy jagnięta urodziły się żywe w 144. do 147. dniu: jagnię 1 (bez komórek) oraz jagnięta 3 i 4 (z komórkami). Praca podaje łączny odsetek żywych urodzeń jako 30%.

Ruch (skala SLR, na 15 punktów):

• Jagnię 1 (bez komórek) uzyskało 15 punktów w 2. godzinie i 15 w 48. godzinie.
• Jagnię 3 (z komórkami) uzyskało 13 punktów w 2. godzinie i 15 w 48. godzinie.
• Jagnię 4 (z komórkami) uzyskało 15 punktów w 2. godzinie i 15 w 48. godzinie.

Wszystkie trzy jagnięta chodziły więc prawidłowo w 48. godzinie, niezależnie od tego, czy otrzymały komórki, przez co wyniki nie mogły wykazać żadnej korzyści.

Tkanka rdzenia kręgowego: U żadnego jagnięcia nie stwierdzono guza, ani gołym okiem, ani pod mikroskopem.

• Średnia gęstość dużych komórek nerwowych wynosiła 20,4 na mm² u nieleczonego jagnięcia wobec 15 i 13,1 na mm² u dwóch leczonych jagniąt. Autorzy zaznaczają, że jest to odwrotność wyników wcześniejszych badań.
• Średnie pole istoty szarej było większe u leczonych jagniąt (274 i 218 jednostek wobec 171 u nieleczonego jagnięcia), a udział istoty szarej w rdzeniu wynosił 0,32 i 0,48 wobec 0,31. Autorzy sugerują, że „mogłoby to ewentualnie wskazywać na lepsze zachowanie tkanki”.
• Pola mierzono w pikselach obrazu i nie podano testów statystycznych porównujących jagnięta.

Wnioski:

Autorzy stwierdzają, że nanoszenie produktu z ludzkich MSC z pępowiny podczas płodowej naprawy rozszczepu kręgosłupa u owiec jest wykonalne i że potrzebne są większe badania z Desacell, aby ocenić ruch, ochronę nerwów i bezpieczeństwo.

Badanie jest pierwszym krokiem technicznym. Ocenić można było tylko jedno nieleczone i dwa leczone jagnięta, więc wyniki nie mogą pokazać, czy komórki działają. Autorzy wymieniają trzy główne ograniczenia: wysoką śmiertelność płodów, która przekreśliła szansę na sensowne porównanie i może odzwierciedlać problemy chirurgiczne niezwiązane z komórkami; brak barwień specjalnych (immunohistochemii), przez co nie mogli potwierdzić, że komórki nadal znajdowały się w naprawionym obszarze; oraz zbyt mało jagniąt, które przeżyły, aby wyniki oceny ruchu cokolwiek znaczyły. Ponadto nieleczone jagnię chodziło prawidłowo, co sugeruje, że wada w tym modelu nie powodowała u tych zwierząt trwałego osłabienia, a przy jednym jagnięciu w każdym porównaniu różnice w istocie szarej i komórkach nerwowych mogą łatwo być przypadkowe. Nie badano wyników długoterminowych, takich jak funkcja pęcherza czy zespół uwięzionego rdzenia, ponieważ jagnięta badano tylko do 48 godzin po urodzeniu.

Informacje dodatkowe:

Rozszczep kręgosłupa dotyczy w Europie około 1 na 2000 ciąż. Badanie MOMS wykazało, że naprawa wady przed urodzeniem o połowę zmniejsza potrzebę zastawki odprowadzającej płyn mózgowo-rdzeniowy i podwaja szansę na chodzenie w wieku 30 miesięcy, ale 58% dzieci operowanych przed urodzeniem nadal nie chodzi samodzielnie. Badacze mają nadzieję, że dodanie komórek macierzystych w trakcie naprawy mogłoby dodatkowo chronić odsłonięty rdzeń kręgowy.

Produkt komórkowy Desacell opisano jako gotowy do użycia produkt wytwarzany według opatentowanego protokołu izolacji. Praca nie podaje nazwy producenta ani właściciela patentu. Autorzy podają, że testowano go na gryzoniach i przedwcześnie urodzonych pawianach, u dorosłych z ciężką niewydolnością płuc (CIRCA-19), u wcześniaków zagrożonych przewlekłą chorobą płuc (HULC-1) oraz że jest badany u dorosłych we wstrząsie septycznym (UC-CISS II). Cytowane badanie na pawianach, kierowane przez współautora Möbiusa, nosi tytuł „Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates”. Dwóch autorów pochodzi z Saxonian Center for Feto/Neonatal Health przy Technische Universität Dresden.

Badanie sfinansowała Niemiecka Wspólnota Badawcza (DFG BA 7308/4-1). Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Praca jest wyłącznie eksperymentem na zwierzętach, a autorzy wskazują trwające badanie CuRe, w którym stosuje się komórki z łożyska na łatce, jako pierwsze badanie u ludzi z komórkami macierzystymi podawanymi podczas płodowej naprawy rozszczepu kręgosłupa.