Immunomodulacyjne mezenchymalne komórki zrębowe z owodni zachowują funkcję mięśni w mysim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a

Najważniejsze punkty i wnioski:

To jest badanie na zwierzętach. Nie leczono żadnych pacjentów. Japoński zespół z Uniwersytetu Tokijskiego, Nippon Medical School i Kaneka Corporation podał ludzkie mezenchymalne komórki zrębowe z owodni (hAMSC) myszom mdx, standardowemu modelowi mysiemu dystrofii mięśniowej Duchenne’a, w powtarzanych wstrzyknięciach do żyły ogonowej i obserwował myszy do roku.

Dla rodziny rozważającej leczenie praca pokazuje, że te komórki wyciszają układ odpornościowy w laboratorium, kierując makrofagi w stronę przeciwzapalnego typu M2, że powtarzane dawki dożylne były tolerowane przez myszy i zmniejszały zapalenie mięśni oraz że leczone myszy po roku zachowały większą siłę chwytu, biegały dalej i miały nieco lepszą funkcję serca. Nie pokazuje, że cokolwiek z tego dzieje się u dzieci. Komórki pochodziły z owodni, a nie z pępowiny, jak komórki używane w naszym programie, i nie przywróciły dystrofiny, brakującego białka, które powoduje chorobę. Komórki dostarczyła firma Kaneka Corporation, która częściowo sfinansowała pracę i zatrudnia czterech autorów.

Cel:

Sprawdzenie, czy hAMSC kierują ludzkie makrofagi w stronę typu M2 oraz czy powtarzane ogólnoustrojowe wstrzykiwanie hAMSC, podane wcześnie w chorobie, poprawia funkcję mięśni szkieletowych i serca u myszy mdx.

Metody:

Komórki. Owodnię pobrano, za zgodą, z błon płodowych kobiet rodzących przez cesarskie cięcie. Komórki wyizolowano przez trawienie enzymatyczne, namnożono, zamrożono i użyto między pasażami 1 a 5. Miały typowe markery MSC (CD73, CD90, CD105), nie miały CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 i HLA-DR, a w hodowli tworzyły kość i chrząstkę, ale nie tłuszcz.

Praca laboratoryjna. Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi hodowano wspólnie z hAMSC w stosunku 20 do 1, a markery makrofagów mierzono cytometrią przepływową i qPCR, z użyciem indometacyny do zablokowania prostaglandyny E2 (PGE2).

Zwierzęta. Samce myszy mdx na tle C57BL/10 losowo podzielono na grupy kontrolną i leczoną. Każda dawka to 8,0 × 10⁵ hAMSC w 100 µL soli fizjologicznej do żyły ogonowej, raz w tygodniu, od wieku 4 do 5 tygodni. Ramię krótkoterminowe dostało cztery dawki (n = 10, ocena w wieku 12 i 18 tygodni, wobec 14 myszy mdx kontrolnych i 7 myszy typu dzikiego). Ramię długoterminowe dostało cztery dawki (n = 6) albo sześć dawek (n = 4) i było oceniane po roku wobec 12 myszy mdx kontrolnych i 7 myszy typu dzikiego. Wiele wyników mierzono w podgrupach od 3 do 8 myszy, podanych poniżej. Z góry określonym głównym wynikiem była długoterminowa funkcja ruchowa (siła chwytu kończyn przednich i szybkość biegu), a histologia była drugorzędna. Badacze nie mogli być zaślepieni co do szczepu myszy, a bieg rejestrowano automatycznym kołem przez pięć dni. Dane wykluczano, gdy mysz straciła na wadze, była ranna albo osłabiona, albo gdy wartość uznano za dziwną.

Wyniki:

Wpływ na odporność w naczyniu. hAMSC zmniejszyły proliferację aktywowanych limfocytów T z 90,1% do 59,9% (p poniżej 0,0001) i wydzielały PGE2. Odsetek komórek CD206-dodatnich (M2) wzrósł umiarkowanie, z 11,3% do 14,2% (p = 0,035), a komórki M1 się nie zmieniły. Indometacyna zniosła wzrost CD206, co wskazuje na PGE2 jako mediator.

Tolerancja. Masa ciała nie różniła się między leczonymi i nieleczonymi myszami mdx w żadnym punkcie. Nie zgłoszono innych miar bezpieczeństwa (badanie narządów, przesiew w kierunku guzów, reakcja immunologiczna na ludzkie komórki).

Krótki czas (wiek od 12 do 18 tygodni, cztery dawki):

• Kinaza kreatynowa w surowicy, marker wycieku z mięśni, była niższa cztery tygodnie po ostatniej dawce (435 ± 79 wobec 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 wobec 4), ale nie po dziesięciu tygodniach (582 wobec 700 ng/mL, p = 0,228). Autorzy nazywają to zmianą przejściową.
• IL-6 w mięśniu piszczelowym przednim: 10,0 ± 3,8 wobec 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 wobec 5).
• Siła chwytu w 12. tygodniu: 336,8 ± 21,0 g wobec 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; po przeliczeniu na masę ciała 10,3 wobec 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 wobec 14).
• Pole makrofagów (F4/80) w przeponie: 14,0% wobec 19,5% (p = 0,013, n = 4 wobec 3). Odsetek makrofagów niosących marker M2 CD206 w mięśniu piszczelowym przednim wzrósł z 17,6% do 55,5% (p poniżej 0,0001).
• Ludzkie komórki znaleziono w mięśniu piszczelowym przednim cztery tygodnie po leczeniu, zajmowały tylko 0,0036% powierzchni skrawka, a po dziesięciu tygodniach ich już nie było. Nie wykryto dystrofiny, więc komórki nie naprawiły podstawowego defektu.

Długi czas (rok, cztery albo sześć dawek, zwykle łącznie):

• Naciek komórek jednojądrzastych w mięśniu piszczelowym przednim: 9,0% w kontrolach, 7,3% po czterech dawkach, 4,7% po sześciu; istotność osiągnęła tylko grupa sześciu dawek (p = 0,038, n = 4 w każdej grupie leczonej wobec 14). Brak różnicy w przeponie.
• Włókna z centralnie położonymi jądrami, oznaka powtarzanego zwyrodnienia i regeneracji: 64,3% wobec 82,0% (p = 0,014, n = 5 wobec 7).
• Włóknienie nie zmniejszyło się w mięśniu piszczelowym przednim, w przeponie ani w sercu.
• Siła chwytu: 296,5 ± 27,2 g wobec 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; po przeliczeniu 8,6 wobec 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 wobec 12). Myszy typu dzikiego osiągnęły 336,4 g, więc leczone myszy znalazły się między tymi dwiema wartościami.
• Maksymalna szybkość biegu się nie różniła (21,6 wobec 20,5 m/min, p = 0,77). Dzienny dystans biegu był większy (3 649 ± 1 025 wobec 2 420 ± 788 m/dobę, p = 0,028, n = 8 wobec 10), podobnie jak średni dystans na minutę (18,3 wobec 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 wobec 5).
• Serce: brak różnicy w budowie makroskopowej, włóknieniu i polaryzacji makrofagów, ale mniejszy naciek komórek jednojądrzastych (n = 6 wobec 6) i wyższe skracanie frakcji lewej komory, 37,0 ± 2,3% wobec 33,6% (p = 0,017; typ dziki 39,6%). Nagłówek tabeli 2 podaje 8 leczonych myszy, podczas gdy jej przypis i legenda rysunku mówią o 5, co jest niespójnością samej pracy.

Wnioski:

Autorzy wnioskują, że wczesne, powtarzane ogólnoustrojowe leczenie hAMSC opóźniło zapalenie i spadek sprawności ruchowej u myszy mdx, prawdopodobnie przez polaryzację makrofagów do typu M2, a nie przez przekształcanie się komórek w mięsień. Sugerują, że można je łączyć ze sterydami albo z terapią genową.

Ograniczenia, które podają autorzy:

• Choroba serca u myszy mdx jest łagodna w porównaniu z pacjentami, więc wyniki dotyczące serca dają ograniczoną informację o ludziach. Proponują potwierdzenie na modelu psim.
• Ludzkie komórki utrzymywały się tylko krótko, a to, jak wydzielane czynniki dają długotrwałe efekty, nie jest ustalone; mechanizm wymaga wyjaśnienia.
• Długotrwała hodowla i namnażanie MSC niosą ryzyko starzenia komórkowego i zmian chromosomowych, a zdolność immunosupresyjna zależy od źródła tkankowego.
• Z metod: badacze nie byli zaślepieni co do szczepu, część danych wykluczono według oceny, a grupy długoterminowe były małe.

Informacje uzupełniające:

Dystrofia Duchenne’a dotyczy około 1 na 3 500 urodzeń chłopców. Sterydy są standardowym leczeniem przeciwzapalnym, ale odpowiedzi są różne, a działania niepożądane częste. Ten sam zespół wcześniej opisał, że powtarzane dożylne komórki macierzyste miazgi zęba utrzymywały aktywność ruchową u myszy mdx i psów z dystrofią. Autorzy zauważają, że podane dożylnie MSC w dużej mierze zatrzymują się w płucach i tam giną, a ich działanie immunologiczne wydaje się wynikać z reakcji własnych fagocytów biorcy na umierające komórki. Praca nie zawiera danych o komórkach z pępowiny i nie wspomina o żadnym badaniu u ludzi z komórkami z owodni w dystrofii Duchenne’a.