Pierwsze zastosowanie u człowieka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiej pępowiny w operacji uwolnienia uwięzionego rdzenia kręgowego

Najważniejsze punkty i wnioski:

Praca jest opisem przypadku jednego dziecka. Dwuletnia dziewczynka z rozszczepem kręgosłupa przeszła w Niemczech operację uwolnienia uwięzionego rdzenia kręgowego, a w trakcie zabiegu chirurdzy nanieśli bezpośrednio na jej rdzeń pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) pozyskane z mezenchymalnych komórek zrębu z pępowiny. EV nie są komórkami. To drobne, otoczone błoną pakiety uwalniane przez komórki, które według obecnej wiedzy przenoszą znaczną część przeciwzapalnych i przeciwbliznowych sygnałów wytwarzanych przez mezenchymalne komórki zrębu.

Preparat dało się podać i w ciągu sześciu miesięcy nie wystąpiło żadne zdarzenie niepożądane. Nie wykazano korzyści, a funkcja nóg dziewczynki się nie zmieniła. Pojedynczy przypadek bez porównania nie pozwala ustalić niczego więcej, co autorzy wielokrotnie podkreślają. Uwzględniamy ten raport, ponieważ opisuje pierwsze u człowieka dokanałowe zastosowanie preparatu pochodzącego z komórek pępowiny u dziecka z rozszczepem kręgosłupa. Dotyczy też uwięzienia rdzenia i jego bliznowacenia po pierwotnej operacji naprawczej, czyli problemu, z którym wiele rodzin styka się później.

Cel:

Sprawdzenie, czy nanoszenie EV pochodzących z MSC z pępowiny (UC-MSC-EV) na rdzeń kręgowy podczas operacji uwolnienia uwięzionego rdzenia jest technicznie wykonalne, z długoterminową nadzieją na ograniczenie bliznowacenia wewnątrz opony twardej i dalszego uszkodzenia nerwów.

Metody:

Otwarta wada cewy nerwowej u dziewczynki została rozpoznana przed urodzeniem. Zamknięto ją mikrochirurgicznie w dniu porodu przez cięcie cesarskie w Szpitalu Uniwersyteckim w Lipsku, a w wieku 6 tygodni dziecko wymagało założenia zastawki komorowo-otrzewnowej. Rutynowy rezonans magnetyczny w wieku jednego roku wykazał w miejscu operacji trzy problemy: rosnący wewnątrz rdzenia guz inkluzyjny typu torbieli skórzastej (dermoid), uwięzienie rdzenia oraz jamę wypełnioną płynem (jamistość rdzenia) obejmującą odcinek lędźwiowy i piersiowy rdzenia. Funkcja ruchowa nie uległa pogorszeniu i pozostawała na poziomie funkcjonalnym L3. Zespół ocenił ryzyko przyszłego pogorszenia jako wysokie i zalecił operację.

Leczenie podano poza badaniem klinicznym, jako „indywidualną próbę leczniczą” (jednorazowe zastosowanie u konkretnej pacjentki). Zostało ono ocenione przez wewnętrzną komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Salzburgu, a rodzice wyrazili pisemną zgodę na eksperymentalne podanie dokanałowe.

Preparat: EV wytworzono zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania na Uniwersytecie Medycznym Paracelsusa w Salzburgu w Austrii, który ma zezwolenie na produkcję MSC-EV do badań fazy od 1 do 3.

• Źródło: MSC z pępowiny od jednego dawcy, przechowywane jako główny i roboczy bank komórek i badane według norm Farmakopei Europejskiej.
• Komórki hodowano z 5% zbiorczego lizatu ludzkich płytek krwi, bez substancji pochodzenia zwierzęcego. W chwili pozyskania były w 8. pasażu, po około 17 podwojeniach populacji.
• EV zbierano z pożywki bezsurowiczej po 24 godzinach, zagęszczano metodą filtracji stycznej przez filtr 100 kDa, sterylnie filtrowano przez filtr 0,22 mikrometra i przechowywano w temperaturze -80°C w fiolkach po 2 mL.
• Użyta partia zawierała 6,5 × 10¹⁰ cząstek na mL o średniej średnicy 130,7 nm i 0,768 mg białka na mL. Wykazywała oczekiwane markery EV (CD9, CD63, CD81) i markery MSC (CD29, CD44, CD49e, CD73) i była ujemna pod względem HLA-ABC i HLA-DR. Nie wykryto cytokin IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10 ani TNF-alfa. Stężenie endotoksyn wynosiło 0,83 IU/mL. Aktywność biologiczną potwierdzono testem enzymatycznym CD73.

Operacja: Zabieg wykonano w pozycji na brzuchu przy ciągłym monitorowaniu neurofizjologicznym. Chirurdzy stwierdzili silne uwięzienie rdzenia przez tkankę dermoidalną wewnątrz cewy nerwowej oraz przylegającego do worka oponowego tłuszczaka i usunęli obie zmiany. Następnie EV podano w następujących krokach:

• 1,0 mL płynu z EV naniesiono na otwartą płytkę nerwową i do jamy jamistości
• płytkę nerwową zamknięto szwami 8-0
• 0,5 mL naniesiono na zszytą płytkę nerwową
• 0,5 mL umieszczono w worku oponowym podczas jego szczelnego zamykania

Łączna objętość podana dokanałowo wynosiła 2,0 mL, czyli według naszego wyliczenia z podanego stężenia około 1,3 × 10¹¹ cząstek.

Wyniki:

• Monitorowanie nie wykazało pogorszenia w trakcie operacji. Odpowiedzi ruchowe były obecne we wszystkich segmentach, łącznie ze zwieraczem, a bezpośrednia stymulacja wykazała czynne korzenie ruchowe aż do poziomu S2.
• Przebieg pooperacyjny był niepowikłany i dziewczynka wróciła do domu po 7 dniach.
• Rezonans magnetyczny w 5. dniu wykazał dobre uwolnienie rdzenia, brak obrzęku rdzenia i mniejszą jamę jamistości.
• W ciągu sześciu miesięcy obserwacji nie wystąpiły zdarzenia niepożądane.
• Funkcja ruchowa się nie zmieniła i pozostała na poziomie L3. Badanie neuropediatryczne po sześciu miesiącach wykazało nieznacznie poprawione czucie i regulację temperatury w obu nogach.

Streszczenie pracy podaje, że deficyt neurologiczny „pozostał niezmieniony”. Opis przypadku w treści artykułu dodaje nieznaczną poprawę czucia. Oba zgodnie stwierdzają, że ruchomość się nie poprawiła.

Wnioski:

Autorzy stwierdzają, że bezpośrednie nanoszenie UC-MSC-EV podczas operacji rozszczepu kręgosłupa jest wykonalne i powinno zostać zbadane w modelach zwierzęcych oraz w badaniach fazy I/II. To, czy przynosi trwałą korzyść neurologiczną, „wymaga dokładnego zbadania w badaniach z randomizacją i grupą kontrolną”.

Autorzy wymieniają kilka ograniczeń:

• Nie było grupy kontrolnej ani randomizacji. Dobry wynik rezonansu i stabilna funkcja to efekty, jakie może dać sama udana operacja uwolnienia rdzenia. Autorzy piszą, że nie da się wyciągnąć żadnego ostatecznego wniosku co do korzyści.
• Właściwa dawka jest nieznana. Ilość ustalono na podstawie wcześniejszych prac doświadczalnych i podano jednorazowo. Nie wiadomo, czy większa ilość albo powtarzane dawki inną drogą byłyby lepsze lub bardziej ryzykowne.
• Sześć miesięcy obserwacji to za krótko. Bliznowacenie i ponowne uwięzienie rdzenia rozwijają się przez lata, a opóźnionych działań niepożądanych nie można wykluczyć.
• Odpowiedź może się różnić. Po stronie wytwarzania dawca, numer pasażu i metoda izolacji, a po stronie pacjenta stan układu odpornościowego, mogą zmieniać efekt. U tego dziecka nie zaobserwowano reakcji immunologicznej, ale teoretyczne ryzyko pozostaje.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Informacje dodatkowe:

Uwięzienie rdzenia: Po operacji naprawczej rozszczepu kręgosłupa tkanka bliznowata może przytwierdzić rdzeń do opony twardej. Gdy dziecko rośnie, rdzeń jest rozciągany i może dojść do utraty funkcji. Praca cytuje dane z obserwacji uczestników badania MOMS, według których objawowe uwięzienie rdzenia wymagające operacji wystąpiło nawet u 27% dzieci operowanych przed urodzeniem i u 15% operowanych po urodzeniu, a torbiele inkluzyjne w płytce nerwowej również częściej występowały po operacji prenatalnej (11% wobec 3%). W duńskiej serii przypadków 45 ze 166 pacjentów wymagało uwolnienia rdzenia, najczęściej z powodu postępującej deformacji kręgosłupa (40%), pogorszenia chodu (38%) lub pogorszenia funkcji pęcherza albo jelit (32%). Samo uwolnienie rdzenia wiąże się z około 15% ryzykiem ponownego uwięzienia przez nowe blizny. Obecnie poza staranną techniką chirurgiczną nie ma leczenia, które zapobiegałoby temu bliznowaceniu.

Uzasadnienie zastosowania EV: Cytowane przez autorów badania laboratoryjne i na zwierzętach pokazują, że EV pochodzące z MSC wyciszają stan zapalny i bliznowacenie po urazie rdzenia kręgowego i działają na mikroglej, czyli komórki odpornościowe układu nerwowego. Te same UC-MSC-EV tej grupy badawczej zastosowano wcześniej raz u człowieka, w uchu wewnętrznym podczas operacji wszczepienia implantu ślimakowego, z zadowalającym profilem bezpieczeństwa.